迁移实验（cell migration assay）

 实验材料
（1）ThinCert插入式细胞培养器: 24-well, 8.0-μm pore membranes （Greiner662638）

（2）细胞培养相关试剂：无血清培养基，10％血清培养基，PBS，0.02％EDTA

（3）固定液：甲醇

（4）染色液：Giemsa染液

（5）封片剂：中性树胶

（6）其他：小镊子，棉棒，载玻片，盖玻片

 操作步骤

（1）所有细胞培养试剂和ThinCert放在37℃温育；

（2）待测细胞培养至对数生长期，消化细胞，用PBS和无血清培养基先后洗涤一次，

 用无血清培养基悬浮细胞，计数，调整浓度  为2×105 /ml；

（3）在下室（即24孔板底部）加入600－800μl 含10％血清的培养基，上 室加入100－

 150μl细胞悬液，继续在孵箱培养24小时；

（4）用镊子小心取出ThinCert，吸干上室液体，移到预先加入约800μl甲醇的孔中，室温固定30分钟；

（5）取出ThinCert，吸干上室固定液，移到预先加入约800μl Giemsa染液 的孔中，室温染色15－30分钟；

（6）轻轻用清水冲洗浸泡数次，取出ThinCert，吸去上室液体，用湿棉棒小 心擦去上室底部膜表面上的细胞；

（7）用小镊子小心揭下膜，底面朝上晾干，移至载玻片上用中性树胶封片；

 （8）显微镜下取9个随机视野计数，统计结果。

  注意事项

（1）根据待测细胞体积大小选择合适孔径的ThinCert。常用的为8.0-μm孔径（如

  AGS细胞），如果细胞体积较大可以考虑用10-μm孔径；

（2）根据待测细胞的迁移能力强弱调整细胞数和迁移时间。常规24-well  ThinCert接种细胞数约

 为2≈5×104/well， 迁移时 间 12≈36小时；

（3）由于Greiner公司的24-Transwell内含24个独立的ThinCert，为了避免操作污染，

 每次实验可预先另准备一块24孔普通培养板（Greiner）；

（4）如果细胞迁移能力较弱，下室液体可用3T3细胞无血清培养24小时获得 的上清加50μg/ml FN（Fibronectin），

 具体可查  阅相关文献；

（5）细胞悬液加入膜中央，尽量保证液面水平；

（6）固定染色擦洗时动作小心，避免擦去膜底面的细胞。但一定要充分擦净膜 表面上未迁移的细胞，

 以免影响读数。尤其是  膜周边上可用细牙签或小镊子缠上湿棉花擦洗，但要小心避免将膜戳破；

（7）Chamber和膜上都无法标记，操作时应小心避免混淆实验组和对照组；

（8）充分晾干，避免残留水分导致镜下聚焦不一致。