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实验推荐——分子标记技术AFLP
更新时间:2023-07-03      阅读:1990

实验推荐——分子标记技术AFLP

实验方法原理:

AFLP RFLPPCR两种技术的优点相结合的产物,它既克服了 RFLP 技术复杂、有放射性危害 和 RAPD 稳定性差,标记呈现隐性遗传的缺点;同时具有分辨率高、稳定性好、效率高的优点。但它的技术费用昂贵,对 DNA 的纯度和内切酶的质量要求很高。


其基本原理是先利用限制性内切酶水解基因组 DNA 产生不同大小的 DNA 片段,再使双链人工接头的酶切片段相连接,作为扩增反应的模板 DNA,然后以人工接头的互补链为引物进行预扩增,最后在接头互补链的基础上添加 1—3个选择性核苷酸作引物对模板 DNA 基因再进行选择性扩增,,然后把扩增的酶切片段在高分辨率的顺序分析胶上进行电泳,多态性即以扩增片段的长度不同被检测出来。


AFLP 技术主要特点 :分析所需DNA 量少,仅需 0.5g;可重复性好;多态性强;分辨率高;不需要 Southern 杂交;样品适用性广;


AFLP 技术被认为是一种十分理想、有效的分子标记。

 

实验材料:

1.1           样品保存与运输

样品类型

样品要求

植物材料

新鲜组织、叶片采用硅胶干燥后或干冰运输到实验室

动物材料

新鲜组织,无水乙醇封存低温运输到实验室

DNA

干冰运输到实验室

 

 

 

 

 

实验步骤:

1.2           DNA 提取(实验方法视DNA来源而异,此处以普通植物样本为例)

CTAB法提取

1) 称取材料50mg,液氮研磨三至四次

2) 将粉末放到装有800µl 2×CTAB提取缓冲液的2ml离心管中

3) 加入60µl巯基乙醇混匀,60度预热30min

4) 其间混匀二至三次取出样品于室温放置

5) 待样品冷却到室温加入800µl氯仿:异戊醇(241

6) 振荡混匀,12000rpm离心15min

7) 取上清到一新2ml离心管,加入等体积的氯仿:异戊醇(241),振荡混匀,12000rpm离心15min

8) 取上清到一新2ml离心管中加入1.5倍体积1×CTAB沉淀液,放置20-30min12000rpm离心15min

9) 将沉淀晾干溶于200µl TE-buffer(溶解)

10)      加入400 µl 95% 乙醇,20µl  3M NaAC, -20 ℃ 沉淀1小时

11)      4℃ 离心,12000rpm离心15min

12)      500µl 75%乙醇洗涤,12000rpm离心10min

13)      加入30-50µl TE-buffer

14)      0.8%琼脂糖凝胶电泳检测

备注CTAB法主要针对植物基因组DNA的提取,其它样品:如动物组织、细胞、菌体等公司有相关试剂盒。

 

1.3           限制性酶切及连接反应

反应体系


组分

对照(体积)

样品(体积)

DNA模板(50ng/μl

4μl

4μl

Adapter

1μl

1μl

EcoR I/MseI 

2μl

2μl

10XReaction buffer

2.5μl

2.5μl

10mM ATP

2.5μl

2.5μl

T4 Ligase

1μl

1μl

H2O

7μl

7μl

混匀离心数秒 37℃保温5h 8℃保温4h4℃过夜。

-20℃保存,作为预扩增模板

 

1.4  预扩增

反应体系

组分

体积

DNA

2μl

Pre-ampmix(预扩引物)

1μl

dNTPs

1μl

10XPCR buffer

2.5μl

Taq

0.5μl

ddH2O

18μl


离心数秒,按下列参数进行PCR扩增

94  2min

       94  30S

       56  30S      30 cycles

      72  80S

    72  5min

    4

 

 

1.5 选择性扩增

预扩产物1:20稀释后作为选扩模板

按以下体系混匀后,离心数秒

 

组分

体积

预扩稀释样品

2μl

10XPCR buffer

2.5μl

dNTP  

0.5μl

EcoRI 引物

1μl(共8种)

MseI 引物

1μl(共8种)

Taq

0.5μl

ddH2O

17.5μl 

Total volum

25μl

 

按下列参数设置PCR循环

1)   第一轮扩增参数:94  30S  65  30S  72  80S

2)   以后每轮循环温度递减0.7℃,扩增12轮。

3)   接着按下列参数扩增23

94  30S

55  30S         23 Cycles

72  80S

4)  72   5min

 5 4



 


 

1.6实验结果

ABI377测序仪电泳检测。数据通过GENESCAN软件进分析。

电泳图谱


峰图


原始数据


01数据

遗传聚类图


实验说明:

 

1.7 数据分析说明

1) ROX500分子量内标

      ROX500ROX红色荧光标记的分子量内标,从小到大,片段大小依次为:708090100120140160180190200220240260280300320340360380400425450475490500bp),共25条带。

2) 原始数据

  公司为客户提供ABI377测序仪电泳检测后的片段大小,即原始数据。数据是通过GENESCAN软件进分析,软件每2个碱基读一次数,Marker片段范围为 70-500bp,这样在70-500 bp之间一共读取216个数,由于不可避免的误差,在所设置的片段Bin Range范围内的片段,认为是同一条带,例如:在71.5-73.5 之间,c1 c2扩增条带大小分别为73.00835 71.9044,这样的误差范围在我们的误差允许范围认为是同一条带。

201数据

      在原始数据的基础上,有带的地方替换为1,无带的地方替换为0,这样构成了01数据,同时给客户发一份所有01数据汇总后的总数据。

由于软件要求,我们一般都会给客户把数据处理成NTSYSpc2.1 这个软件要求的标准的01数据格式即01总数据。01总数据中 r1-r216 表示第一个引物,r217-r432 代表第二个引物和01分数据一一对应。

如: 一共有8个引物:a-1a-2a-3b-1b-2c-1d-1…….等,在总数据中按顺序排列:

   R1-  r216 的数据为:a-1 这个引物的数据

   R217-r432 的数据位:a-2 这个引物的数据……..,以此类推。

 

常见问题:

 1)客户委托公司做实验服务,客户需要做哪些工作?

    客户只需提供实验材料,我们负责DNA提取及后续全部试验。收到样品后,我们一般会给客户做预实验,根据客户预实验结果,客户满意度,决定是否安排后续实验。公司现有64个引物组合,全部为FAM荧光标记,我们会从中筛选条带清晰、多态性较好的引物组合给客户。在开始正式实验前,客户需支付课题服务一半的费用,余款在公司给客户发送最后一批数据前,一次结清。

2) 关于AFLP收费价格

目前我们的基本价格是30个样,6~8对引物,6000元,实验周期大约为20天,如果您样品较多或引物组合较多,具体可协商。

3)条带数太多

PCR产物在ABI测序仪上电泳,检测系统的灵敏度要比银染高的多,数据分析是通过GENESCAN软件进行分析,所以对于很弱的带,如果人工统计的话,不会把这样的带统计进去,但软件分析的话,会读到这样的带。所以通过测序仪检测比银染条带数多,这个可以理解。另外我们一般通过控制荧光信号强度来控制条带数,对于扩增强以及扩增相对较弱的引物,通过控制荧光信号强度,尽量保证条带数在50~60条,最大限度减少由于扩增强度的问题,引起的条带数的差异,最真实的反映实验结果。

4)能否找到所有差异带的具体位置,并回收克隆差异条带?

请参照提供数据结果中,原始数据部分,数据表中,每个检测位点都有片段大小,有带的地方是片段的实际大小,无带的为0,很容易找到差异带。目前我们采取的荧光引物,跑测序胶,只能指出差异带的具体位置及片段大小,不能够回收克隆差异带。

5)共有谱带较少,多态性太高

   共有谱带为所有样品在某一位点扩增后共有的条带。因此只要有一个样品的扩增不好,或者在这个样品无扩增,就会导致共有普带数较少或没有。所以一定要保证实验材料新鲜,这样我们才能够保证后续试验中的PCR扩增没问题。如果样品确实有问题,为了不影响整体数据要去除这类样品。

 

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